Uno de los mayores retos en la producción de biocombustibles de segunda generación consiste en identificar enzimas provenientes de microorganismos que, combinadas en un coctel enzimático, hagan viable la hidrólisis de la biomasa. Mediante este proceso, las enzimas actúan juntas para degradar y convertir hidratos de carbono de la paja y del bagazo de la caña de azúcar, por ejemplo, en azúcares sencillos, pasibles de fermentación.

En Brasil, un grupo de investigadores de la Universidad de Campinas (Unicamp), en colaboración con pares del Laboratorio Nacional de Biorrenovables (LNBR), descubrió que un hongo existente en la Amazonia, de la especie Trichoderma harzianum, produce una enzima con potencial para erigirse como la más importante en un cóctel enzimático.

Dicha proteína, denominada β-glucosidasa, de la familia 1 de las glucósido hidrolasas o glucosidasas (GH1), actúa en la etapa final de la degradación de la biomasa y produce glucosa libre para su fermentación y su transformación en etanol. Pero los científicos observaron en el laboratorio que esa misma glucosa producida debido a la reacción enzimática inhibía la actividad de la β-glucosidasa.

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“También constatamos que la excelente actividad de catálisis de la proteína ocurría a 40 grados. Esto constituye otro obstáculo para empleo de esta enzima, pues, en ambientes industriales, la hidrólisis enzimática de la biomasa se efectúa a temperaturas más altas, generalmente de alrededor de 50 grados”, explicó Clelton Aparecido dos Santos, posdoctorando en el Centro de Biología Molecular e Ingeniería Genética de la Unicamp con beca de la FAPESP – Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo.

Mediante análisis de la estructura de la enzima, combinados con técnicas de genómica y de biología molecular, los investigadores lograron efectuar modificaciones en la estructura de la molécula que permitieron solucionar estos problemas y aumentar en forma considerable su eficiencia para degradar biomasa.

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Bagazo de caña de azúcar en la central Santa Fé, Nova Europa, interior de São Paulo. (Foto: Eduardo Cesar/revista Pesquisa FAPESP)
Este estudio, producto de un Proyecto Regular y de un Proyecto Temático, ambos apoyados por la FAPESP, salió publicado en la revista Scientific Reports.

“Verificamos que la proteína modificada que desarrollamos es mucho más eficiente que la enzima no modificada, y puede utilizársela para suplementar los cócteles enzimáticos que se comercializan actualmente para la degradación de la biomasa y la producción de biocombustibles de segunda generación”, declaró Dos Santos.

Para arribar a la proteína modificada, los investigadores inicialmente compararon la estructura cristalográfica de la molécula original con la de otras enzimas β-glucosidasas silvestres de las familias 1 (GH1) y 3 (GH3) de las glucósido hidrolasas. Los resultados de los análisis revelaron que las glucosidasas GH1 más tolerantes a la glucosa exhibían un canal de entrada del sitio activo más profundo y angosto que otras β-glucosidasas. Y mostraron también que ese canal restringía el acceso de la glucosa al sitio activo de la enzima.

En tanto, las β-glucosidasas menos tolerantes a la glucosa poseen un canal de entrada del sitio activo más corto y más ancho, que permite el acceso de una cantidad mayor de la glucosa producida por esas enzimas durante la etapa final de la degradación de la biomasa. La glucosa obstruye el canal de la proteína y disminuye su actividad catalítica.

Con base en esta observación, mediante el empleo de una técnica de biología molecular denominada mutagénesis de sitio dirigido, los científicos efectuaron la sustitución de dos aminoácidos que podrían funcionar como “porteros” en la entrada del sitio activo de la enzima, autorizando o impidiendo el ingreso de la glucosa. Los análisis de los experimentos indicaron que esta modificación provocó el angostamiento del sitio activo de la enzima.

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“El sitio activo de la enzima mutante pasó a poseer una dimensión menor y similar al de las β-glucosidasas GH1 más tolerantes a la glucosa”, afirmó Dos Santos.

Con el objetivo de evaluar el rendimiento de la proteína mejorada en la degradación de biomasa −especialmente del bagazo de la caña de azúcar, un residuo agroindustrial con gran potencial de explotación en Brasil–, los investigadores efectuaron una serie de experimentos. En el marco de una pasantía de investigación en el exterior con beca de la FAPESP, y en colaboración con un grupo de investigadores encabezados por el profesor Paul Dupree, de la Universidad de Cambridge, en Inglaterra, Dos Santos analizó la eficiencia de la enzima mejorada con relación a la liberación de glucosa en la conversión de distintas fuentes de biomasa vegetal.

Los resultados de los análisis indicaron que la enzima modificada presentó una eficiencia catalítica un 300% mayor que la proteína silvestre y se volvió más tolerante a la glucosa, promoviendo así un aumento significativo de la liberación de azúcar de todas las fuentes de biomasa vegetal testeadas. Asimismo, la mutación incrementó la estabilidad térmica de la enzima durante la fermentación.

“La mutación de los dos aminoácidos en el sitio activo de la proteína la convirtió en una enzima extremadamente eficiente, lista para su aplicación industrial”, dijo Anete Pereira de Souza, docente de la Unicamp y coordinadora del proyecto. “Una de las ventajas de esta enzima reside en que se la produce in vitro y no a partir de un organismo modificado, en este caso, el hongo. De este modo, es posible producirla en grandes cantidades y reducir los costos”, sostuvo.